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染色質(zhì)免疫沉淀原來學問這么多？
日期：2025-05-11 19:48
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摘要：
染色質(zhì)免疫沉淀原來學問這么多？
原理：在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復合物，并將其隨機切斷為長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合物，特異性的富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片段的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。
一般步驟：甲醛處理細胞——收集細胞，超聲破碎——加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復合物相互結(jié)合——加入Protein A，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復合物，并沉淀——對沉淀下來的復合物進行清洗，除去一些非特異性結(jié)合——洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復合物——解交...
染色質(zhì)免疫沉淀原來學問這么多？
原理：在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復合物，并將其隨機切斷為長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學方法沉淀此復合物，特異性的富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的片段的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。一般步驟：甲醛處理細胞——收集細胞，超聲破碎——加入目的蛋白的抗體，與靶蛋白-DNA復合物相互結(jié)合——加入Protein A，結(jié)合抗體-靶蛋白-DNA復合物，并沉淀——對沉淀下來的復合物進行清洗，除去一些非特異性結(jié)合——洗脫，得到富集的靶蛋白-DNA復合物——解交聯(lián)，純化富集的DNA-片段——PCR分析。在PCR分析這一步，比較傳統(tǒng)的做法是半定量-PCR，但是現(xiàn)在隨著熒光定量PCR的普及，大家也越來越傾向于Q-PCR了。
注意事項：
細胞生長狀態(tài)要好，它會直接影響細胞內(nèi)部的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡；
所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實驗成功的關(guān)鍵，抗體不同和抗原結(jié)合能力也不同，是IP級別的抗體才能實驗結(jié)果的可靠性；
交聯(lián)與超聲破碎是ChIP中難把握的部分，一般理想的超聲破碎得到的片段大小是200bp-1000bp，不同的細胞類型可能會有適宜交聯(lián)與超聲條件上的差別；
為防止蛋白的分解、修飾，溶解抗原的緩沖液加蛋白酶抑制劑，低溫下進行實驗。
